Предстательная железа Википедия

Спонтанная ритмическая активность органов мочевой системы

Соколова И. Б., Зинькова Н. Н., Шведова Е. В., Кругляков П. В., Полынцев Д. Г. 2007 Распределение мезенхимальных стволовых клеток в области тканевого воспаления при разных способах введения клеточного материала. Клеточные технологии в биологии и медицине. 1 34-38. 2007
ООО "Транс-Технологии", С-Петербург.
Научный руководитель - к. б. н. Д. Г. Полынцев

Один из актуальных вопросов современной клеточной терапии - выбор способа доставки клеточного материала в область тканевого повреждения.

На крысах - самцах инбредной линии Вистар - Киото проведено исследование распределения мезенхимальных стволовых клеток (МСК) по организму в интактном состоянии и при наличии очага острого тканевого воспаления. В здоровое животное МСК были трансплантированы внутривенно. Во втором случае были использованы разные способы введения МСК: внутривенное, в пограничную с воспалением ткань, в интактную долю поврежденного органа (предстательной железы). Через 3 недели в интактном животном флуоресцентно меченые МСК были выявлены в костном мозге и кишечнике. При наличии в организме очага воспаления после внутривенной трансплантации МСК мигрировали в костный мозг, кишечник и предстательную железу. При введении в пограничную с воспалением тканевую зону МСК располагались в месте укола компактным конгломератом. В случае трансплантации в интактную долю предстательной железы клетки мигрировали в сторону воспаления.

Авторы делают заключение, что трансплантация МСК в венозную кровь является наименее травматичной и приводит к более равномерному распределению клеток по поврежденной ткани.

Ключевые слова: мезенхимальные стволовые клетки, флуоресцентная метка, распределение, воспаление.

В настоящее время клеточная терапия с помощью мезенхимальных стволовых клеток (МСК) становится общепризнанным методом лечения различных патологий. Один из практических вопросов применения МСК связан с выбором места трансплантации клеточного материала. Предлагают трансплантировать клетки в венозную кровь [8], непосредственно в место повреждения [9] или в артерию, питающую данный орган [3]. Интраорганные трансплантации, как правило, сопряжены со сложным оперативным вмешательством. Введение клеточного материала в венозную кровь представляет собой рутинную медицинскую процедуру. К настоящему времени доказано, что МСК, введенные в венозную или артериальную кровь, мигрируют в орган - мишень [5, 7]. Предполагают, что МСК мигрируют в область тканевого некроза из-за того, что при наличии воспалительных и некротических процессов в ткани повышается содержание SDF-1 (stromal cell derived factor). В то же время МСК - это клетки с высоким уровнем экспрессии CXCR4 - рецептора к SDF-1, что, вероятно, и стимулирует выход этих клеток из костного мозга и их миграцию в очаг повреждения [4, 10, 6].

Цели данной работы: 1. Выяснить, каково распределение МСК по интактному организму крысы после внутривенной трансплантации. 2. Как влияет наличие очага острого воспаления на распределение МСК по организму крысы после внутривенной трансплантации. 3. Как влияет способ трансплантации МСК на распределение этих клеток по тканям органа с выраженным очагом воспаления.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на 60 крысах - самцах линии Вистар - Киото массой 150 - 170 г. Возраст животных - 3 - 4 месяца.

Выделение и культивирование МСК крыс. Суспензию костного мозга выделяли из бедренных костей животных сразу после декапитации. В стерильных условиях удаляли эпифизы бедренных костей, а диафизы промывали средой культивирования ( MEM (Hyclone, Новая Зеландия), 20% сыворотки крови эмбрионов коров (Gibco, США) и 100 мкг/мл пенициллина/стрептомицина (Gibco, США)). Полученный смыв высевали на пластиковые чашки Петри (Sarstedt, Германия). Через 48 ч после эксплантации костного мозга проводили двукратную процедуру отмывки МСК от форменных элементов крови с помощью фосфатно - солевого буферного раствора PBS (20 мМ фосфатный буфер, pH 7,4; 0,1 M NaCl). Клетки культивировали в монослое в вышеназванной среде культивирования при 37оС и 5% СО2 в течение 6-7 сут после эксплантации. В дальнейшем культуру пересевали каждые семь суток с исходной плотностью 1,27х103 клеток/см2. Для пересева культуры МСК крыс использовали раствор трипсина и ЭДТА (Hyclone, Новая Зеландия). Замену питательной среды проводили каждые трое суток.

Фенотипирование МСК крыс проводили методом проточной цитофлуориметрии на проточном цитофлуориметре FACSscan (Beckton Dickinson, США). МСК окрашивали антителами против негативного маркера CD45 (Beckton Dickinson, США) и антителами против позитивного маркера CD90 (Beckton Dickinson, США). Для окрашивания антителами против поверхностных маркеров клетки снимали с чашек раствором трипсина и ЭДТА (Hyclone, Новая Зеландия), промывали два раза PBS, затем на один час переносили в раствор моноклональных антител, коньюгированных с флуорохромом, в разведении 1:20. Далее клетки промывали два раза раствором PBS и оценивали интенсивность свечения. Фенотипирование проводили после первого, второго и третьего пересева культуры.

Окрашивание МСК крыс флуорохромом РКН26 проводили после второго пересева культуры. Клетки наращивали до плотного монослоя, далее в среду культивирования добавляли РКН26 (Sigma, США) в концентрации 1мкг/мл на 48 ч. Затем клетки промывали раствором PBS и культивировали в среде без РКН26 не менее 4 ч. Окрашенные МСК снимали с чашек раствором трипсина и ЭДТА, центрифугировали при 450g в течение 10 мин. Полученный осадок дважды промывали PBS и суспендировали в питательной среде без сыворотки ( MEM +100 мкг/мл пенициллина/стрептомицина) с финальной концентрацией 5х106 клеток в 100 мкл. Эффективность окрашивания МСК оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica (Leica, Германия).

Моделирование острого воспаления в паренхиматозной ткани - предстательной железе осуществляли путем введения 200 мкл раствора скипидара в растительном масле (1 : 1) в левую долю железы.

Группы экспериментальных животных (рис. 1):

  1. Интактные животные. Этим животным внутривенно вводили 5млн МСК в 100 мкл среды.
  2. Животные, которым через 3 сут после моделирования острого воспаления трансплантировали МСК внутривенно в описанных выше количествах.
  3. Животные, которым через 3 сут после моделирования острого воспаления трансплантировали 0,2 млн МСК в 100 мкм среды в тканевую зону, пограничную с областью воспаления.
  4. Животные, которым через 3 сут после моделирования острого воспаления трансплантировали 0,2 млн МСК в 100 мкм среды в интактную долю предстательной железы.
 Схема способов трансплантации МСК крысам
Рис. 1. Схема способов трансплантации МСК крысам.
а - внутривенно; б - в интактную долю предстательной железы; в -в пограничную с местом воспаления область предстательной железы.

Всех животных декапитировали через 3 недели после моделирования острого воспаления.

Фиксация тканей. Непосредственно после декапитации у животных, которым МСК были трансплантированы внутривенно (группы 1 и 2) отбирали образцы тканей костного мозга, кишечника, печени, легких и предстательную железу целиком. У животных, которым МСК были трансплантированы интраорганно (группы 3 и 4) фиксировали только предстательную железу целиком. Образцы тканей охлаждали 10 с в парах азота, на 1 ч помещали в жидкий азот, а затем переносили на хранение при температуре -70оС.

Детекцию флуоресцентно меченых МСК в тканях проводили с помощью флуоресцентного микроскопа (Leica, Германия) на гистологических препаратах толщиной 7 мкм, изготовленных на криостатном микротоме (Leica, Германия).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выявление МСК в организме животных из группы 1 показало, что через 3 недели после трансплантации флуоресцентно меченые клетки присутствовали в костном мозге и кишечнике и единично в легких и печени (рис. 2).

 Распределение МСК (внутривенное введение) в интактном животном (а - д) и при наличии в организме острого локального воспаления в предстательной железе (е - к)
Рис. 2. Распределение МСК (внутривенное введение) в интактном животном (а - д) и при наличии в организме острого локального воспаления в предстательной железе (е - к).
а, е - костный мозг
б, ж - кишечник
в, з - печень
г, и - легкие
д, к - предстательная железа.

У животных их группы 2 меченые МСК были выявлены в костном мозге, кишечнике и в поврежденной (левой) доле предстательной железы. При этом они располагались вокруг капли скипидара и диффузно по области воспаления (рис. 3, а). У животных из группы 3 меченые клетки лежали компактным конгломератом в месте введения (рис. 3, б). У животных из группы 4 выявлена тенденция клеток к миграции в сторону зоны воспаления: флуоресцентная зона представляет собой тяж между местом введения и поврежденной долей предстательной железы (рис. 3, в). Но в области воспаления меченые МСК не обнаружены.

 Распределение МСК по предстательной железе
Рис. 3. Распределение МСК по предстательной железе.
а - внутривенное введение; б - введение в интактную долю предстательной железы; в - введение в пограничную с местом воспаления область предстательной железы.
Стрелками обозначены флуоресцентно меченые МСК; с - капля скипидара.

Итак, мы показали, что через 3 нед после внутривенной трансплантации в интактном организме животного МСК можно обнаружить только в костном мозге и в кишечнике. Наличие очага острого воспаления не изменяет распределение МСК по организму. Но при этом меченые клетки в обязательном порядке выявляются в поврежденном органе. Эти данные подтверждаются и нашими работами с крысами, у которых был смоделирован инфаркт миокарда. Было показано, что независимо от срока внутривенного введения относительно перевязки коронарной артерии, МСК распределялись по области инфаркта, а также в костном мозге и кишечнике[1, 2].

При введении в пограничную с воспалением область, МСК не распространялись от места укола по зоне тканевого повреждения. В то же время при трансплантации в интактную долю предстательной железы МСК проявили тенденцию к передвижению в сторону воспаления, но миграция по паренхиматозной ткани оказалась практически невозможной. Эти данные позволяют предположить, что интраорганное введение может оказаться малоэффективным, по крайней мере, в случае воспаления предстательной железы.

Итак, наиболее универсальным для всех патологий, безопасным и легко применимым является внутривенный способ трансплантации МСК. Это приводит к равномерному, диффузному распределению клеток по области повреждения ткани.

ЛИТЕРАТУРА

  1. Кругляков П. В., Соколова И. Б., Аминева Х. К., Некрасова Н. Н., Вийде С. В., Чередниченко Н. Н., Зарицкий А. Ю., Семернин Е. Н., Кислякова Т. В., Полынцев Д. Г. 2004. Терапия экспериментального инфаркта миокарда у крыс с помощью трансплантации сингенных мезенхимных стволовых клеток. Цитология. 12: 1043 - 1054.
  2. Кругляков П. В., Соколова И. Б., Аминева Х. К., Некрасова Н. Н., Вийде С. В., Чередниченко Н. Н., Зарицкий А. Ю., Семернин Е. Н., Кислякова Т. В., Полынцев Д. Г. 2005. Влияние сроков трансплантации мезенхимных стволовых клеток на репарацию сердечной мышцы крыс после инфаркта. Цитология. 5: 404 - 416.
  3. Assmus B., Schachinger V., Teupe C., et al. 2002. Transplantation of progenitor cells and regeneration enhancement in acute myocardial infarction (TOPCARE-AMI). Circulation. 106: 3009 - 3017.
  4. Bhakta S., Hong P., Koc O. 2006. The surface adhesion molecule CXCR4 stimulates mesenchymal stem cell migration to stromal cellderived factor - 1 in vitro but does not decrease apoptosis under serum deprivation. Cardiovasc. Revasc. Med. 7: 19 -24.
  5. Ji J., He B., Dheen S., Tay S. 2004. Interactions of chemokines and chemokine receptors mediate the migration of mesenchymal stem cells to the impaired site in the brain after hypoglossal nerve injury. Stem cells. 22: 415 - 427.
  6. Li Y., Chen J., Wang L., Lu M., Chopp M. 2001. Treatment of stroke in rat with intracarotid administration of marrow stromal cells. Neurology. 56: 1666 - 1672.
  7. Orlic D. 2003. Adult bone marrow stem cells regenerate myocardium in ischemic heart disease. Ann. N. Y. Acad. Sci. 996: 152 - 157.
  8. Tomita S., Mickle D., Weisel R., et al. 2002. Improved heart function with myogenesis and angiogenesis after autologous porcine bone marrow stromal cell transplantation. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 123: 1132 - 1140.
  9. Wynn R., Hart C., Corradi-Perini C., et al. 2004. A small proportion of mesenchymal stem cells strongly expresses functionally active CXCR4 receptor capable of promoting migration to bone marrow. Blood. 104: 2643 - 2645.

 

Источник: http://www.trans-t.ru/science/pub/pub_7.php